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ELISA試劑盒雙抗體夾心法是查看抗原zui常用的方法，操作過程如下：
將特異性抗體與固相載體聯合，構成固相抗體。
洗刷除去別的未聯絡物質。
加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體聯絡。
洗刷除去未聯絡的抗體及雜質。
加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體聯絡，構成固相抗原抗體復合物。
*洗刷未聯絡的酶標抗體。
此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量有關。
抗體的來歷為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不一樣種屬的動物。
如運用單克隆抗體，一般挑選兩個關于抗原上不一樣抉擇簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶聯絡物。
類同于堆積反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上），如按常法測讀，所得效果將低于實踐的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），由于標準曲線到達后呈鉤狀彎落。
ELISA試劑盒雙抗體夾心法鉤狀效應嚴重時，反應乃至可不顯色而出現假陰性效果。
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能構成兩位點夾心。
在臨床查驗中，此法適用于查驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。
只需獲得關于受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶聯絡物而樹立此法。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體聯絡，而不再構成"夾心復合物"。
運用一步法試劑測定標本中含量可反常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應留心可測規模的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不一樣位點上富含多個一樣的抉擇簇，例如HBsAg的a抉擇簇，也可用關于此抉擇的同一單抗分別包被固相和制備酶聯絡物。
但在HBsAg的查看中應留心亞型疑問，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有一樣的a抉擇簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應留心的疑問。
ELISA試劑盒雙抗體夾心法測抗原的另一留心點是類風濕因子（RF）的煩擾。
RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段聯絡。
用作雙抗體夾心法查看的血清標本中如富含RF，它可充任抗原成份，一起與固相抗體和酶標抗體聯絡，表現出假陽性反應。
選用F（ab'）或Fab片段作酶聯絡物的試劑，由于去除了Fc段，然后消除RF的煩擾。
ELISA試劑盒雙抗體夾心法本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不一樣，尋覓適合的符號方法。